PeproTech細胞因子和重組蛋白溶解正確使用方法

PeproTech的所有細胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細胞因子和蛋白凍干粉非常穩(wěn)定，在-20o C或-80o C條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系或注射入動物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，因溶解不好會導(dǎo)致細胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實際使用中經(jīng)常遇到的問題。

應(yīng)該如何進行正確的溶解呢？

下面我們以Recombinant Human IL-5 (重組人IL-5，產(chǎn)品編號：200-04)的說明書為例，對細胞因子或蛋白的溶解方法進行詳細的闡述。

第 1 步：開蓋前離心試劑管

PeproTech的細胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉*溶解。

有很多用戶會問一個問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時間離心試劑管，才能達到良好的收集效果？

答：有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個Spin鍵，按了此鍵后，離心機會自動快速上升到其大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到高點后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個過程大約30s。這個Spin鍵足以很好的將細胞因子或蛋白收集到管底。

但有些實驗室沒有這樣的高速離心機，只有高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達到類似的效果。

第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。

 這個步驟即為溶解步驟，非常重要。

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉

用于溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-5需用水溶解，而重組人IL-2 (產(chǎn)品編號：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1 (產(chǎn)品編號：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產(chǎn)品編號：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產(chǎn)品編號：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產(chǎn)品編號：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的說明書為準)。后續(xù)的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。

經(jīng)常有用戶會問，為什么會有這么多種溶解方法？

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強度。PeproTech的細胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴格測試，說明上所標明的溶解液是能夠?qū)⒃摷毎蜃踊蛑亟M蛋白*溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標明的不符，很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能*溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？

答：有時可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時千萬不能用PBS或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時用PBS溶解*沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。

2) 一定要溶解到的濃度。

蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍，該例為0.1-1.0 mg/ml。這個濃度范圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產(chǎn)品編號：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B(產(chǎn)品編號：120-15)則一定要是0.5mg/ml。

3) 一定不能振蕩(vortex)

這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。

有用戶會問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實現(xiàn)細胞因子或重組蛋白的*溶解，該怎么辦呢？

答：多數(shù)細胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細胞因子或重組蛋白*溶解。

第 3 步：該重懸液在 2-8oC長可保存 1 周。

用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細胞因子或重組蛋白可放置在2-8o C，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細胞因子或重組蛋白的活性長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗，如DC(樹突狀細胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。

其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4o C保存，待1周內(nèi)用完。如進行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白 ( 如 0.1% BSA ，或 10% FBS ，或 5% HSA) 的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于 -20oC 至 -80oC 。

如果一個實驗周期長于一周，或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20o C至-80o C，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。

經(jīng)常有人會在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20oC至-80oC，這樣可以嗎？

答：不行。我們知道，塑料管壁對多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實驗的人都知道，ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標板上的。

載體蛋白，如1% BSA，10% FBS (胎牛血清)和5% HSA等的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點，使細胞因子或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大為降低，終表現(xiàn)為細胞因子或重組蛋白活性的下降。

因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。 稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。